W zaproponowanym rozwiązaniu elementem czułym na zmiany stężenia jonów wodorowych jest fragment sondy bogaty w cytozyny, które w warunkach słabo kwaśnych są zdolne do tworzenia par cytozyna-cytozyna protonowana, co w konsekwencji prowadzi do uformowania czteroniciowej struktury i-motywu. W ramach wspomnianego projektu otrzymano obustronnie znakowane pirenami latarnie molekularne z i-motywem w pętli oraz wykazano wpływ stabilności dwuniciowego rdzenia na właściwości tych sond. Otrzymane latarnie opatrzono skrótem pHSO, gdzie pHSO to akronim angielskiego wyrażenia pH Sensitive Oligonucleotide tzn. pH-wrażliwy oligonukleotyd. Latarnie pHSO wykazywały mierzalny sygnał analityczny w postaci emisji ekscymerowej pirenów, charakteryzującej się zakresem liniowej odpowiedzi na zmiany pH w przedziale 7,5-6,25 czyli w zakresie odpowiadającym zmianom wewnątrzkomórkowego pH oraz bardzo czułej na małe zmiany pH (nawet 0,1 jednostki pH). Dzięki współpracy z prof. dr hab. E. Kierzek (IChB PAN, Poznań) oraz dr A. Fedoruk-Wyszomirską (IChB PAN, Poznań), udało się udowodnić, iż opracowane przez nas sondy typu latarni molekularnych z i-motywem w pętli są trwałe in cellulo oraz emitują fluorescencję obserwowaną pod mikroskopem konfokalnym. Co więcej, w celu realnej oceny potencjalnych zastosowań latarni z i-motywem w pętli jako sondy do pomiarów zmian pH wewnątrz komórek, komórki nowotworowe linii HeLa transfekowano sondą pHSO i wymuszono zmianę pH za pomocą leku tj. chlorokwiny. Badania komórkowe z użyciem mikroskopu konfokalnego potwierdziły, iż latarnie molekularne z i-motywem w pętli nie tyko kumulują się w lizosomach, ale też reagują na zmiany pH w komórkach nowotworowych.

c)

Rys.  Graficzne przedstawienie zasady działania obustronnie znakowanej pirenami latarni molekularnej z i-motywem (oznaczonym na jasnoniebiesko) w pętli, gdzie dodatkowo zawarto schemat pary cytozyna-cytozyna protonowana (a) oraz obrazy mikroskopii konfokalnej pokazujące: umiejscowienie sondy pHSO_D (o zielonkawoniebieskej fluorescencji) w lizosomach (barwionych na czerwono) we wnętrzu komórki (b) oraz wpływ działania chlorokwiny na pracę sondy pHSO_A (o zielonkawoniebieskiej fluorescencji) (c) [https://doi.org/10.1016/j.aca.2017.07.040].

Otrzymane wyniki jednoznacznie wskazują na potencjał w zakresie wykorzystania sond typu pHSO do monitorowania dynamicznych zmian pH w lizosomach. Substancje lizosomotropowe są badane w terapiach przeciwnowotworowych pod kątem zdolności ułatwiania działania cytostatyków, ponieważ wewnątrzlizosomalne pH komórek nowotworowych jest prawie o 0,5 jednostki niższe niż w komórkach zdrowych.

W świetle powyższych rezultatów uważamy, iż latarnie molekularne z i-motywem w pętli mogłyby być wykorzystane jako narzędzie do monitorowania zmian wewnątrzkomórkowego pH, odzwierciedlających zmiany w metabolizmie różnych linii komórek nowotworowych wywołanych zastosowaniem leków przeciwnowotworowych. W niniejszym projekcie chcielibyśmy wykorzystać nasze sondy pHSO do porównania działania wybranych leków przeciwnowotworowych na komórki różnego typu nowotworów. Wstępne pomiary fluorescencyjne dla hodowli komórkowych transfekowanych sondą pHSO i poddanych działaniu wybranych leków, przewidziane są do wykonania w grupie badawczej prof. dr hab. B. Rubisia (na Uniwersytecie Medycznym w Poznaniu). Natomiast pomiary z użyciem konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego dla hodowli komórkowych transfekowanych sondą pHSO i poddanych działaniu wybranych leków  będą wykonywane  we współpracy z dr A. Fedoruk-Wyszomirską (IChB PAN, Poznań). Interdyscyplinarny charakter zespołu badawczego odpowiedzialnego za realizację projektu, w tym wykonanie badań spektroskopowych, jak i komórkowych, w szczególności tych z użyciem konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego powinien być niezwykle pomocny w realizacji przedstawionego wyżej planu badawczego.

Niezaprzeczalnie liczba zachorowań na nowotwory złośliwe na całym świecie, także w Polsce, znacznie wzrosła. Trwają liczne badania nad coraz to skuteczniejszymi metodami wykrywania oraz leczenia nowotworów. Jedną z potencjalnych możliwości jest kontrola wewnątrzkomórkowego pH oraz monitorowanie zmian pH pod wpływem leków antynowotworowych. Stąd jest potrzeba konstrukcji jak i udoskonalania wysoce czułych oraz równocześnie mało-inwazyjnych narzędzi do pomiarów pH w przestrzeni wewnątrz- oraz zewnątrzkomórkowej.

Powiązanie zmian wewnątrzkomórkowego pH wywołanych działaniem leków (np. przeciwnowotworowych) na skuteczność działania takich leków mogłoby przyczynić się do opracowania skuteczniejszych medykamentów oraz innowacyjnych terapii (np. antynowotworowych). W dalszej perspektywie dałoby to korzyści w opiece zdrowotnej społeczeństwa narażonego na występowanie chorób, z szczególnym uwzględnieniem chorób nowotworowych.